После изучения данной главы вы сможете:
— Называть все части светового микроскопа и области его применения;
— Описывать другие типы микроскопов, а именно цифровой и электронный микроскопы;
— Выделять особенности строения ткани при световой микроскопии:
• Клетка
◦ Ядро
◦ Цитозоль (цитоплазма)
• Внеклеточный матрикс
— Давать краткое описание этапам подготовки образцов к визуализа-
ции под световым микроскопом;
Распознавать наиболее распространенные методы гистологического окрашивания, в том числе его основной принцип, цветовую гамму, какие компоненты клетки подходят для окрашивания, как разные красители дают представление о строении и функционировании клеток и тканей:
◦ Окрашивание гематоксилином и эозином
◦ Окрашивание реактивом Шиффа (PAS)
• Иллюстрировать примерами, как обработка ткани влияет на ее внешний вид и что данные особенности говорят о структуре и функционировании клеток или тканей конкретного среза
— Подбирать наиболее подходящие методы гистологического анализа (тип микроскопа и краситель) для исследования.
1.1 Микроскопия
1.1.1 Световой микроскоп
Визуализация мелких образцов, которые не видны невооруженным глазом, осуществляется с помощью микроскопа. И хотя цифровая микроскопия постепенно вытесняет традиционную в качестве наиболее предпочтительного метода гистологических исследований, но понимание того, как работает оптического микроскоп все еще остается полезным навыком при анализе и образцов с предметного стекла, и их оцифрованных изображений. Ниже приведено краткое описание классического микроскопа, которое может незначительно отличаться от его других модификаций.
Световой микроскоп предназначен для увеличения изображения ткани, размещенной на предметном стекле (Рис. 1.1). Свет от источника освещения (лампы) фокусируется посредством конденсора, проходит изначально сквозь образец на предметном столике, а затем — сквозь систему линз (объективов и окуляра), увеличивая изображение среза.
На Рис.1.1 головка (синий квадрат) развернута в противоположную от пользователя сторону для удобства хранения. Ослабив фиксирующий винт в основании головки можно ее повернуть. Наилучший подход к изучению изображения под микроскопом — поворот головки на 180°. И обратно, когда микроскоп не используется.
Предметное стекло с образцом фиксируется на столике специальными держателями или зажимами. Механизм передвижения столика по осям X-Y может смещать его в направлении вперед-назад или вправо-влево, что позволяет изучить образец под разными углами.
Источником света выступает лампочка в основании микроскопа.
Для настройки яркости освещения имеется кнопка включения- выключения подсветки и регулятор яркости.
Конденсор фокусирует исходящий от лампы свет прежде, чем он достигнет образца. С помощью специального регулятора высоту конденсора можно менять. При работе с большинством предметных стекол конденсор должен находится ниже их на 1 мм.
После того, как свет пройдет через образец на предметном стекле, его изображение увеличивается с помощью двух объективов. Как правило, на револьверной головке микроскопа есть 3-4 нижних объектива (турелей), которые можно чередовать для получения желаемого размера изображения. Верхний объектив называется окуляром (см. ниже). Увеличенное изображение получается путем комбинирования верхнего и нижних объективов. Для удобства использования, а также во избежание повреждения объективов и стекол, всегда следует начинать работу с объектива с наименьшим увеличением (кратностью 4х). Взяв образец в фокус, можно постепенно переключаться на большее увеличение (кратностью 10х, 40х и 100х).
Рис. 1.1 Типичный световой микроскоп
Фокусировка образца происходит с помощью регуляторов, поднимающих и опускающих столик. Регулятор грубой фокусировки перемещает столик быстрее, и его следует использовать только при низком увеличении. Взяв изображение в фокус, нужно переключиться на объектив с большим увеличением и использовать регулятор точной фокусировки.
И, наконец, окуляры — как правило, 10-кратные — также увеличи- вают изображение. При исследовании образца следует использовать оба глаза во избежание возникновения многочисленных головных болей. Одной из важных особенностей окуляров является возможность на- стройки межзрачкового расстояния, которое на микроскопе регулируется под расположение глаз того, кто им пользуется.
Помните, что для этого у одних микроскопов имеется отдельный регулятор межзрачкового расстояния, у других — можно двигать сами окуляры.
Еще одна важная настройка отвечает за то, чтобы оба глаза видели изображение в фокусе. Один из окуляров обычно снабжен регулятором диоптрий, который меняет для него фокальную плоскость. Для этого закройте глаз, который смотрит в окуляр, требующий настройки (на Рис. 1.1 это левый глаз), и корректируйте изображение во втором окуляре («с фиксированным фокусом») с помощью регуляторов грубой и тонкой фокусировки до тех пор, пока оно не станет четким. Затем закройте другой глаз и настраивайте фокусировку на первом окуляре с помощью регулятора диоптрий, пока изображение также не приобретет четкие черты.
1.1.2 Цифровая микроскопия
Оптические микроскопы веками применялись для изучения образцов на предметных стеклах и до сих пор используются многими практикующими врачами и учеными. Однако цифровая микроскопия становится все более востребованной и уже является стандартом, который во многих школах применяется для гистологических исследований.
Для создания цифровых слайдов изображений предметные стекла с образцами сканируются в слайд-сканере. Полученные данные могут храниться в нескольких форматах, но просматривать оцифрованные изображения можно с помощью любого компьютера (Рис. 1.2). Управление очень интуитивно и понятно. Так, чтобы переместить слайд, его достаточно перетащить мышью. Если у нее есть колесико прокрутки, его можно использовать (иногда в сочетании с клавишей Ctrl) для измене- ния размера изображения. Или же использовать меню (обведено кружком на Рис. 1.2). В правом верхнем углу показано отсканированное изображение слайда. Прямоугольником выделена та область, которая в данный момент видна на экране, и ее размер меняется в зависимости от степени увеличения. Каждая система для оцифровки слайдов имеет свои отличия. Их функциональность варьируется в зависимости от операционной системы, типа мыши и других настроек компьютера. Исследование — лучший метод познания.
Рис. 1.2 Цифровой слайд.
1.1.3 Традиционная микроскопия в сравнении с цифровой
В классическом оптическом микроскопе изображение увеличивается путем умножения кратности линз объективов и окуляров. Степень увеличения объектива можно выбирать самому, а вот окуляры, как правило, имеют 10-кратное увеличение. Если в револьверной головке стоит 40-кратный объектив, то максимально изображение увечится в 400 раз (40 х 10).
При создании цифровых слайдов используются только объективы, аналогичные тем, что установлены в оптическом микроскопе. В зависимости от системы цифровой слайд может иметь панель масштаба, которая определяет величину изображение. Чтобы ее изменить, достаточно навести курсор мыши на панель и отредактировать масштаб с помощью колеса прокрутки. Как правило, таким способом можно максимально увеличить изображение в 20 или 40 раз. Тут можно подумать, что масштабирование цифровых слайдов сильно уступает оптическим микроскопами. Но не стоит забывать, что в последнем изображение проецируется через крошечные окуляры, в то время как цифровые слайды отображаются на больших компьютерных мониторах с высоким разрешением.
1.1.4 Другие виды микроскопии
Существуют и другие виды микроскопов для визуализации клеток и тканей (например, фазово-контрастный, конфокальный), которые выходят за рамки данной публикации. Но об одном из них —просвечивающем электронном микроскопе —все же стоит упомянуть. Основные принципы работы схожи со световой микроскопией за исключением того факта, что вместо света через образец проходит пучок электронов. Изображение имеет большее увеличение и разрешение, чем под оптическим микроскопом. Анализ электронных микрофотографий будет рассмотрен в следующей главе.
1.2 Основные характеристики клеток и тканей
Прежде чем приступать к углубленному изучению гистологии, стоит начать со схемы одиночной клетки (Рис. 1.3). Хотя в этой книге подробно не затрагиваются темы цитологии (на молекулярном уровне), общая структура и функции компонентов клетки будут описаны в последующих главах. На данный момент следует знать, что:
— Внешняя клеточная мембрана — плазматическая мембрана —
отделяет содержимое клетки от внеклеточного матрикса.
— Клетка содержит множество органелл, наиболее значимой из них является ядро.
— Все содержимое клетки, помимо ядра, называется
цитоплазмой (или цитозолем, хотя эти два понятия не совсем тождественные.
Микровосинки
Типичная клетка
Реснички
Пероксисома
Cекреторные везикулы
Цитоплазматическая мебрана
Свободные рибосомы
Внеклеточный матрикс
Ядрышко Ядро (ядерная мембрана)
Ядерные поры
Лизосома
Комплекс Гольжи
Гладкий эндоплазматический ретикулум
Митохондрия
Шероховатый эндоплазматический ретикулум
Рис. 1.4 Печень: клетки (зеленый контур) и ядра (синие стрелки).
расположенная вокруг ядер и преимущественно над ними, является цитоплазмой. Плазматическая мембрана между клетками по большей части не просматривается, за исключением отдельных областей (черные стрелки).
Рис. 1.3 Упрощенная схема типичной клетки.
На Рис. 1.4 увеличенное изображение печени. С него удобно начать знакомиться с гистологией, поскольку все клетки печени четко выражены (пример выделен зеленым пунктиром).
Наиболее заметной органеллой клетки, которую можно легко увидеть в оптический микроскоп, является ядро (Рис. 1.4, выделено синими стрелками). На этом слайде оно имеет синеватый оттенок. Остальное содержимое клетки (на слайде имеет розовато-фиолетовый оттенок) — это цитоплазма. Внутри нее органеллы слишком малы, чтобы их можно было визуализировать с таким разрешением.
Вещество между клетками называется внеклеточный матрикс. Однако состав этой бледно-розовая ткани в печени (и других органах) имеет более сложную структуру, поскольку включает в себя кровенос- ные сосуды, которые в свою очередь тоже состоят из клеток, и другие элементы соединительной ткани (подробнее об этом написано далее).
У клеток на Рис. 1.4 четко видны их границы. Однако это скорее исключение из правил. На участке ткани между зелеными скобками (Рис. 1.5) находится приблизительно от 30 до 50 клеток, в зависимости от количества учитываемых ядер (одно выделено синими стрелками). Розовая область,
Рис. 1.5 Участок кишечника. Видны от 30 до 50 клеток эпителия (зеленые скобки), одиночная клетка (пунктир), граница между двумя клетками (черные стрелки), ядро (синие стрелки).
Рис. 1.6 Глотка. Видны эпителий (зеленые скобки) и соединительная ткань (желтые стрелки).
Рис. 1.7 Схема образца ткани в фиксирующем растворе.
На Рис. 1.6 показано другое изображение для практики. Область между зелеными скобками заполнена более чем сотней клеток. Большинство из них имеют кубическую (квадратную) или округлую форму. Как правило, границы между большинством клеток отчетливо видны, особенно на среднем и верхнем участках снимка. В тех местах, где границы клеток не видны, рекомендуется мысленно их прорисовывать.
1.3.2 Заливка
Поскольку образцы органов и других тканей могут быть разных форм и размеров, после фиксации они заливаются специальной средой для более удобного использования и резки. В результате материал оказывается внутри твердого блока из заливочной среды (Рис. 1.8).
1.3 Подготовка образцов
Для изучения гистологии необязательно полностью знать все детали процесса подготовки исследовательского материала. Однако общее понимание процедуры облегчит интерпретацию гистологических срезов.
Четыре основных этапа подготовки образцов:
1. Фиксация
2. Заливка
3. Резка
4. Окрашивание
1.3.1 Фиксация ткани
С помощью фиксации останавливают метаболизм клеток и предотвра- щают разложение тканей. Это достигается посредством реагентов, которые приводят к формированию перекрёстных сшивок белков (химическая фиксация). На Рис. 1.7 показано схематическое изображение сердца, погруженного в фиксирующий раствор.
Химическая фиксация занимает много времени и разрушает структуру белка. В случаях, когда сроки ограничены, а активность ферментов нужно сохранить, используется метод быстрой заморозки. Это процедура, при которой ткань вместо химического фиксатора погружают в жидкий азот.
Рис. 1.8 Образец ткани в заливочной среде.
Рис. 1.9 Схематическое изображение проникновения заливочной среды в ткань. (а) Среда не проникла в ткань. (б) Среда полностью проникла в ткань.
Рис.1.11 Неокрашенная ткань.
Рис. 1.10 Резка ткани.
Клетки печени на Рис. 1.12 были окрашены гематоксилином и эозином. Обратите внимание, что, окрашивая отрицательно заряженные молекулы ДНК, гематоксилин придает ядру синий цвет (обозначено стрелками), в то время как эозин окрашивает белки в цитоплазме в красно-розовый. Белки во внеклеточных областях (обозначено пунктиром) также являются эозинофилами.
Рибосомы — это клеточные структуры в цитоплазме, которые синтезируют белок. Поскольку они содержат базофильную РНК с отрицательным зарядом, клетки, активно синтезирующие большое количество белка, демонстрируют частичное
окрашивание гематоксилином отдельных участков цитоплазмы. Это добавляет к ее обычному розовому цвету синий, придавая цитоплазме темно-фиолетовый оттенок. Это явление называется цитоплазматической базофилией.
На Рис. 1.13 изображение поджелудочной железы, окрашенной гематоксилином и эозином. В поджелудочной железе и других органах скопления нескольких
клеток называются ацинусами (черный пунктир, Рис. 1.13). Большая часть клеток в ацинусе имеет пирамидальную форму (желтый пунктир). На этом изображении у большинства клеток наблюдается цитоплазматическая базофилия, особенно в областях вокруг ядер. Две клетки с
интенсивной цитоплазматической базофилией обозначены желтыми стрелками.
1.3.3 Резка
После заливки из ткани изготавливают тонкие (толщиной 5-15 мкм) срезы на микротоме, которые размещают на предметных стеклах (Рис. 1.10). На Рис. 1.10 показаны только три среза, но из одного образца можно получить сотни срезов.
Этот процесс называется последователь- ной резкой, поскольку все срезы создаются из одного и того образца ткани.
1.3.4 Окрашивание
Через окрашивание улучшают визуализацию клеточных компонентов. Для этого существует специальный ряд процедур, и каждая выделяет разные элементы клеточной структуры.
Процедуры варьируются от относительно неселективного окрашивания на основе заряда клеточных компонентов до крайне специфического метода, зависящего от антитело-антиген реакции.
На Рис. 1.11 изображено предметное стекло со срезом кишечника, который либо не окрашен, либо окрашен, но очень плохо. Этот рисунок дает представление о том, как выглядит неокрашенная ткань.
В следующих параграфах представлены две самые распространен- ные технологии окрашивания:
— Гематоксилином и эозином
— Реактивом Шиффа (PAS)
Гематоксилин и эозин
Гематоксилин — синий краситель, который локализуется в отрицательно заряженных клеточных структурах (например, дезоксирибонуклеиновой кислоте [ДНК], рибонуклеиновой кислоте [РНК]). Структуры, которые окрашиваются гематоксилином, называются базофильными.
Эозин — красно-розовый краситель, который локализуется в положительно заряженных клеточных структурах (например, в белках и митохондриях). Структуры, которые окрашиваются эозином, как правило, называют эозинофильными или ацидофильными (иногда).
Рис. 1.12 Окрашенная гематоксилином и эозином ткань печени. Видны ядра клеток печени (синие стрелки) и соединительная ткань (пунктир).
Рис. 1.13 Поджелудочная железа, окрашенная гематоксилином и эозином . Видны ацинус (черный пунктир), отдельная клетка (желтый пунктир) и цитоплазматическая базофилия (желтые стрелки).
Рис. 1.14 Воспаленная ткань, окрашенная гематоксилином и эозином. Видны клетки с цитоплазматической базофилией (синие стрелки) и без нее (зеленые стрелки). На снимке также виден кровеносный сосуд (пунктир) с эритроцитами (черная стрелка).
На Рис. 1.14 еще одно изображение клеток с цитоплазматической базофилией (синие стрелки). Сравните их с клетками с эозинофильной цитоплазмой (зеленые стрелки).
а
Клетки с большим содержанием цитоплазматических белков демонстрируют повышенный уровень эозинофилов. На Рис. 1.15а изображены клетки с большим содержанием митохондрий (черный пунктир), а на Рис. 1.15б — срез скелетных мышц.
Как реакция цитоплазмы на окрашивание дает нам ключ к пониманию функционирования клетки, так и реакция ядра на окрашивание указывает на ту или иную клеточную активность. Генетический материал, он же ДНК, может находиться в ядре, в кон- денсированном неактивном (гетерохроматин) или в декон- денсированном активном (эухроматин) состоянии. Наличие конденсированной ДНК в клетке приводит к тому, что ядра меньшего размера имеют наиболее насыщенную окраску (черные стрелки, Рис.1.16). Активная клетка, наоборот, демонстрирует крупное и бледной ядро (желтые стрелки).
б
Рис. 1.15 (а) Паращитовидная железа, окрашенная гематоксилином и эозином. Видны клетки с повышенной цитоплазматической эозинофилией (контуром). (б) Скелетные мышцы, окрашенные гематоксилином и эозином.
Рис. 1.16 Печень. Видны ядра активных (желтые стрелки) и неактивных (черные стрелки) клеток.
Окрашивание реактивом Шиффа (PAS)
Окрашивание реактивом Шиффа (PAS) — метод окрашивания для выделения углеводов. Структуры, реагирующие на реактив, приобре- тают ярко-пурпурный (фиолетовый) окрас и называются PAS-положи- тельными (PAS+). В противовес, срез ткани обычно обрабатывается основным красителем, чтобы лучше выделить ядро. К структурам PAS+ внутри клетки относятся аппарат Гольджи, плазматическая мембрана и наполненные слизью везикулы бокаловидных клеток. Данные органел- лы будут подробно рассмотрены в последующих главах.
На Рис. 1.17 изображена ткань, окрашенная PAS. Липидный бислой плазматических мембран содержит углеводный компонент гликокалик- сом. Благодаря ему границы клеток ткани после окрашивания имеют более четкие черты. Клетки, которые положительно реагируют на интенсивное окрашивание реактивом (черные стрелки), содержат в своей цитоплазме множество секреторных везикул, наполненных гликопротеинами. Многие другие структуры в клетках и внеклеточном матриксе также являются PAS+. Более подробная информация о них будет представлена в следующих главах.
1.3.5 Артефакты
Это последняя тема, затрагивающая процесс подготовки материала для исследования. Артефакты — это особенности подготовленного среза, которые отсутствовали в исходном образце, но возникли в результате его подготовки.
Рис. 1.17 Тощая кишка, окрашенная PAS. Видны богатые углеводами бокаловидные клетки (черные стрелки).
Отсутствие окрашивания в цитоплазме свидетельствует о наличии специфических молекул в ткани. Некоторые компоненты клетки плохо впитывают те или иные красители. Например, клетки печени (гепато- циты) содержат гликоген, который плохо поддается стандартным кра- сителям гематоксилину и эозину. На Рис. 1.18 показано, как изменение уровня гликогена в гепатоцитах приводит к местами неравномерному окрашиванию цитоплазмы. До некоторой степени все клетки демонстрируют слабое цитоплазматическое окрашивание. Но отдельно можно выделить клетки с множеством абсолютно чистых участков, а следовательно, с большим количеством гликогена (выделено пунктиром).
Некоторые клеточные компоненты также могут вымываться из образца во время фиксации ткани. На месте остается чистая область, которая и является ключом к тому, что когда-то существовало в исходной ткани. В коре надпочечников липоидные тельца хранятся в цитоплазме клеток в качестве предшественников стероидных гормонов, вырабатываемых клетками. Эти тельца смываются при стандартной подготовке срезов. На Рис. 1.19 степень окрашивания цитоплазмы варьируется в зависимости от области. Клетки с наиболее «размытой» цитоплазмой расположены в центре снимка.
Рис. 1.18 Печень. Видны клетки со слабой степенью окрашивания (пунктир) вследствие большого присутствия гликогена.
Рис. 1.19 Надпочечник. Видны области слабого окрашивания (в центре) вследствие большого присутствия липоидных телец.
Рис. 1.20 Гиалиновый хрящ. Видны клетки (черные стрелки), пустые лакуны (синие стрелки) и внеклеточный матрикс.
матрикс имеет полужидкую структуру, поэтому он сжимается меньше, чем содержащиеся в нем клетки (черные стрелки). Из-за этого образуются полости (лакуны), в которых располагаются сморщенные клетки. При резке они часто выпадают из своих лакун.
Еще одним артефактом процесса подготовки образцов является усадка ткани. Это происходит в большинстве случаев, хотя некоторые виды фиксации могут заметно минимизировать степень усадки. Не все ткани в срезах сжимаются одинаково. Когда соседние тканевые структуры сжимаются с разной степенью, они начинают отслаиваться друг от друга, образуя пустоту внутри среза. К примеру, на Рис. 1.20 дано изображение хрящевой ткани, у которой внеклеточный
Рис. 1.21 показаны два примера артефактов, которые не столь полезны. На Рис. 1.21а изображено поперечное сечение эластичной артерии. Во время усадки ткани сосуд как бы складывается внутрь самого себя, образуя темные загибы (зеленые стрелки), которые не являются реальными клеточными структурами, а лишь участками ткани, наложенными друг на друга. На Рис. 1.21б снимок разорванной ткани (черная стрелка) с какой-то инородной частицей (синяя стрелка).
1.4 Заключение
Гистология — это наука об изучении биологических структур столь маленьких, что их невозможно увидеть невооруженным глазом. Для их изучения используются микроскопы, которые увеличивают изображе- ния структур. Существует альтернативный способ, когда ткани скани- руются и сохраняются в электронном формате (цифровые слайды). Для визуализации ткань
должна пройти несколько этапов подготовки: фиксация, заливка, резка и окрашивание. Для выделения
конкретных структур используют разнообразные красители. Самые распространенные их них — гематоксилин и эозин. Ядра клеток окрашенных ими срезов имеют синий цвет, а цитоплазма и внеклеточный матрикс, как правило, розовый.
Также цитоплазма клеток, синтезирующих большое количество белка, изобилует рибосомами, а значит при окрашивании гематоксилином и эозином будет демонстрировать цитоплазматическую базофилию. Другим распространенным гистологическим красителем является реактив Шиффа (PAS), способный выделять углеводы. Артефакты — это особенности среза ткани, появляющиеся во время его подготовки. Это могут быть неокрашенные области, следы вымывания компонентов или усадка ткани. Артефакты могут быть полезны при определении функции клетки или при идентификации типов тканей.
Рис. 1.21 (а) Аорта. Видны складки ткани (зеленые стрелки).
(б) Пищевод. Виден разрыв тканей (черная стрелка) и инородное тело (синяя стрелка).
Внимание! Этот перевод, возможно, ещё не готов.
Его статус: идёт перевод
Переведено на Med-library.ru: https://med-library.ru/book/3/6
Переводчики: Donatello, Mikelangelo
Готово: